传统发酵技术的应用
课题1果酒和果醋的制作
发酵
1、概念：利用微生物或其他生物的细胞在有氧或无氧条件下繁殖或积累其代谢产物的过程。
2、类型：
（1）根据是否需要氧气分为：需氧发酵和厌氧发酵。
（2）根据产生的产物可分为：酒精发酵、乳酸发酵、醋酸发酵等。
一、基础知识
（一）果酒制作的原理
1．菌种是酵母菌，属于真核生物，新陈代谢类型异养兼性厌氧型，
有氧时，进行有氧呼吸，大量繁殖，反应式为：C6H12O6+6H2O+6O2→6CO2+12H2O+能量；无氧时，能进行酒精发酵，反应式为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2+能量。
2．酵母菌繁殖的最适温度20℃左右，酒精发酵一般控制在18～25℃。
3．自然发酵过程中，起作用的主要是附着于葡萄皮上的野生型酵母菌。也可以在果汁中加入人工培养的酵母菌。
（二）果醋制作的原理
1．菌种是醋酸菌，属于原核生物，新陈代谢类型为异养需氧型。只有在氧气充足时，才能进行旺盛的生命活动。变酸的酒表面观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖形成的。
注意：醋酸菌是原核生物,虽然没有线粒体,但在它们细胞膜的内侧上有许多与有氧呼吸有关的酶,所以可以进行有氧呼吸，另外蓝藻和硝化细菌等虽然也是原核生物，但也可以进行有氧呼吸。
2．当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，
当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，
反应简式为C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O。
3．醋酸菌的最适合生长温度为30～35℃。
4．菌种来源：到生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买，或从食醋中分离醋酸菌。
二、实验设计
1、流程图
2、装置：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；
排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；排气口要
通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的
是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是
有利于二氧化碳的排出。·使用该装置制酒时，应
该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。
出料口是用来取样的。
三、课题延伸
果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。
K2Cr2O7+3C2H5OH+4H2SO4→3CH3CHO(乙醛）+K2SO4+Cr2(SO4)3+7H2O酸性重铬酸钾有强氧化性，更易将酒精氧化，一般用硫酸酸化。生成的硫酸铬呈灰绿色。
检测时，先在试管中加入发酵液2mL，再滴入3mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴。
（一）旁栏思考题
1.你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？
答：应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
2.你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
提示：需要从发酵制作的过程进行全面的考虑。例如，榨汁机、发酵装置要清洗干净；每次排气时只需拧松瓶盖、不要完全揭开瓶盖等。
3.制葡萄酒时，为什么要将温度控制在18～25℃？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在30～35℃？
答：温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20℃左右最适合酵母菌繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35℃，因此要将温度控制在30～35℃。
4.制葡萄醋时，为什么要适时通过充气口充气？
答：醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气。
课题2腐乳的制作
一、基础知识
腐乳制作的原理
1．腐乳的发酵有多种微生物的协同作用，包括青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉，它是一种真核生物，新陈代谢类型是异养需氧型。
2．毛霉等微生物产生的蛋白酶可以将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可以将脂肪水解成甘油和脂肪酸。
3．现代的腐乳生产是在严格的无菌条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品的质量。
4.条件控制：温度：控制在15~18°C，，并保持一定的湿度。
二、实验设计
1、实验流程
让豆腐长出毛霉→加盐腌制→加乳汤装瓶→密封腌制。
3~5天8天
（一）旁栏思考题
1.你能利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？
答：豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。
2.王致和为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？
答：盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。
3.我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？
答：含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形。
4.吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？
答：“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。“皮”对人体无害。
课题3制作泡菜
一、制作原理
1、微生物是乳酸菌，其代谢类型是异养厌氧型。乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。所以制作泡菜时的乳酸菌是群落，而不是种群。
2、原理：在无氧条件下，将糖分解为乳酸（乳酸发酵）
3、分裂方式是二分裂。
二、实验设计
1．腌制条件
腌制过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量。
温度过高、食盐用量不足10％、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。一般在腌制10天后，亚硝酸盐的含量开始下降。在腌制后的前6天内，泡菜中的亚硝酸盐含量就可以达到最高峰。而第9天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降。这可能是由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌），这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作，使其生长繁殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。
2.泡菜坛的选择
泡菜坛本身质地好坏对泡菜与泡菜盐水有直接影响，故用于泡菜的坛子应经严格检验，其优劣的区分方法如下：①观型体:泡菜坛以火候老、釉质好、无裂纹、无砂眼、形体美观的为佳。②看内壁:将坛压在水内，看内壁，以无砂眼、无裂纹、无渗水现象的为佳。③视吸水:坛沿掺入清水一半，用废纸一卷，点燃后放坛内，盖上坛盖，能把沿内水吸干（从坛沿吸入坛盖内壁）的泡菜坛质量较好，反之则差。④听声音:用手击坛，听其声，钢音的质量则好，空响、砂响、音破的质次。
3.材料
（1）各种蔬菜均可，一般用白菜、洋白菜、黄瓜、柿子椒、胡萝卜、白萝卜等。
（2）添加的调味品，如花椒、八角等。
（3）白酒。
（4）食糖和盐。
4.步骤
（1）各种菜洗净并切成3～4cm长的小块。
（2）将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。
（3）将各种蔬菜、盐水、及调味品放入坛，混合均匀。如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1分钟后入坛，再加上一些白酒。
（4）将坛口用水封好，防止外界空气进入。
（5）泡菜发酵
发酵前期：蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物，主要是以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内形成缺氧状态。
发酵产物中除乳酸外，还有其他，如乙醇、CO2等称异型乳酸发酵。
发酵中期：由于前期乳酸的积累，pH下降，缺氧状态的形成，乳酸杆菌活跃进行活跃的同型乳酸发酵，乳酸积累pH达3.5~3.8.大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为完全成熟阶段，泡菜有酸味且清香品质最好。
发酵产物中只有乳酸，称为同型乳酸发酵。
发酵后期：继续进行乳酸发酵，乳酸积累达1.2％以上时，乳酸杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。
腌制1周左右即可开坛食用。也可随时加入新鲜蔬菜，不断取用。
（6）如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于接种已经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。
（一）旁栏思考题
1.为什么含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶？答：酸奶的制作依靠的是乳酸菌的发酵作用。抗生素能够杀死或抑制乳酸菌的生长，因此含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶。
2.为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不吃存放时间过长、变质的蔬菜？答：有些蔬菜，如小白菜和萝卜等，含有丰富的硝酸盐。当这些蔬菜放置过久发生变质（发黄、腐烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康。
3.为什么泡菜坛内有时会长一层白膜？你认为这层白膜是怎么形成的？答：形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖。
4.加入白酒有什么作用？白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，它也是一种调味剂，可增加醇香感。
5.用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么结果？水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，空气中21％是氧气，这是最简易的造成无氧环境的方法。这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂。
6.乳酸菌除了可以用于制作泡菜，还可以用于牛奶发酵。那么，在牛奶的发酵过程中会产生亚硝酸盐吗？酸奶制作过程中并不需要使用盐,所以没有产生亚硝酸盐。
三、亚硝酸盐含量的测定
1、测定亚硝酸盐含量的原理
在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，再与N-1－萘基乙二胺盐酸盐结合生成玫瑰红溶液。将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量。
2、配制标准液
用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml亚硝酸钠溶液，分别置于50ml比色管中，再取1支比色管作为空白对照。并分别加入2.0ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5分钟后，再分别加入1.0mlN-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馏水至50ml，混匀，观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化,用分光光度计读数，并绘制标准曲线。
3、测定样品液中亚硝酸盐含量
吸取40ml透明澄清的样品液，转移到50ml比色管中，将比色管做好标记。按步骤2的方法分别加入对氨基苯磺酸溶液和N-1－萘基乙二胺盐酸盐溶液，并定容至50ml，混匀，静置15分钟后，观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，用分光光度计读数，根据标准曲线计算出对应的亚硝酸钠含量，重复实验三次，取平均值。
附：分光光度计的原理。
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
常见考点归纳
1、几种常用发酵菌种的比较
2、果酒、果醋、腐乳、泡菜制作中所用菌种及控制条件的比较
3、果酒、果醋、腐乳和泡菜制作过程的比较及亚硝酸盐含量的检测
例题1．下列有关实验的叙述，不正确的是
A．果酒、果醋的发酵，需要对发酵原料进行严格的灭菌
B．提取鸡血细胞中的DNA，需用蒸馏水使细胞吸水涨破
C．观察细胞中染色体形态的变化，应选择具有分裂能力的细胞
D．观察动物细胞中核酸的分布，用盐酸处理可改变细胞膜通透性
答案A
2.下列实验准备工作中合理的是
A.为了倒平板将已凝固的固体培养基加热熔化
B.为了恢复干酵母的活力将其用沸水处理
C.为观察植物有丝分裂准备洋葱鳞片叶
D.为双缩脲试剂鉴定蛋白质的实验准备沸水浴
答案A
3．下列实验做法不．能达到实验预期的是
A．用兔成熟红细胞制备细胞膜和粗提取DNA
B．制作泡菜时向坛盖边沿的水槽中注满清水
C．制作果酒时适时拧松瓶盖，制作果醋时持续供氧
D．用稀释涂布平板法估测某土壤浸出液中活菌数目
答案A
4．下列关于高中生物学实验的原理、方法或选材的叙述，正确的是
A．制作果醋时，通氧不足或温度过低会使发酵受影响
B．利用稀释涂布平板法对细菌计数时需借助于显微镜
C．只要生物材料中含丰富的葡萄糖和果糖，就可直接用于还原糖的鉴定
D．利用二苯胺试剂鉴定细胞提取物，若产生蓝色变化即表明有RNA存在
答案A
5.制作果酒、果醋和泡菜三个实验的共同点是
A.菌种为异养原核生物B.将原料灭菌后再发酵
C.保证无氧环境下发酵D.发酵液最终呈现酸性
答案D
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